مقدمه: L-asparaginase آنزیم دارویی برگرفته شده از باکتری اشرشیاکلی می باشد و یکی از داروهایی است که در درمان سرطان خون حاد لنفوبلاستیک به کار می رود. کاهش آسپاراژین خون بعد از استفاده از آنزیم آسپاراژیناز می تواند مرگ را برای این سلول ها به دنبال داشته باشد. هدف از این طرح، بررسی امکان تولید و تخلیص آنزیم آسپاراژیناز می باشد. روش ها: ژن آنزیم آسپاراژیناز موجود در ژنوم باکتری اشرشیاکلی با استفاده از تکنیک PCR تکثیر شد. پس از تخلیص، ژن فوق در وکتور pET28a کلون و به میزبان باکتری انتقال داده شد. پس از ترانسفورماسیون، شرایط مختلف بیان پروتیین جهت بهینه سازی بررسی گردید. بیان آنزیم نوترکیب به کمک SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. سپس آنزیم آسپاراژیناز با روش کروماتوگرافی تمایلی و با کمک ستون حاوی رزین Ni-NTA و روش هیبرید خالص شد و در نهایت فعالیت آنزیمی آن بررسی گردید. یافته ها: بیشترین میزان تولید آنزیم آسپاراژیناز در باکتری در دمای 37 درجه ی سانتی گراد، غلظت 1 میلی مولار از القاگر و زمان 20 ساعت پس از القاء بود. آنزیم آسپاراژیناز نامحلول با استفاده از ستون نیکل خالص شده و روی ستون فرایند تاخوردگی مجدد (Refolding) انجام شد. با توجه به فعالیت آنزیم ریفولد شده در تست فعالیت آنزیمی می توان نتیجه گرفت فرایند تاخوردگی مجدد آنزیم به درستی انجام شده است. نتیجه گیری: به دلیل اهمیت زیاد تولید آنزیم آسپاراژیناز در ایران و نیاز گروهی از بیماران برای استفاده از این آنزیم، در این پروژه با بهینه کردن فرایند بیان و تخلیص، آنزیم L-asparaginase در مقیاس آزمایشگاهی تولید شد.

سابقه و هدف: باکتری های کلستریدیوم بوتولینوم هفت نوع نوروتوکسین تولید می کنند که تیپ های A، B،E  و F منجر به بوتولیسم در انسان می شوند. یکی از روش های درمانی بوتولیسم می تواند از طریق مهار فعالیت آنزیمی ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم توسط مهارکننده ها باشد. در این مطالعه، ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E در وکتور بیانی pET28a همسانه سازی و در باکتری میزبان E. coli سویه BL21(DE3) بیان شده است.مواد و روش ها: به منظور همانندسازی ناحیه مورد نظر،DNA  ژنومی باکتری استخراج گردید. با استفاده از واکنش PCR توالی مورد نظر تکثیر شد. سپس محصول PCR در وکتور pGEM-T Easy وارد و وکتور نوترکیب به سلول های میزبان E. coli سویه DH5a منتقل گردید. سپس با واکنش الحاق محصول همسانه سازی شده از وکتور pGEM-T Easy به وکتور بیانی pET28a منتقل شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب pET28a به باکتری E. coli سویه BL21(DE3) انتقال داده شد. بیان ناحیه کاتالیتیک در شرایط استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت.یافته ها: نتایج حاصل از برش آنزیمی و واکنش PCR بیانگر همانندسازی و زیر همانندسازی به ترتیب در وکتورهایpGEM-T Easy  و pET28a بود. نتایج تعیین توالی نیز صحت حضور توالی مورد نظر را تایید کرد. در نهایت بیان قطعه مورد مطالعه، با استفاده از ژل SDS-PAGE و آزمایش وسترن بلات تایید گردید.استنتاج: همسانه سازی توالی مورد مطالعه، به ترتیب در وکتورهای pGEM-T Easy و pET28a با صحت کامل انجام گرفت. همچنین نتایج بیان و تایید محصول بیانی در باکتری E. coli BL21(DE3) بیانگر صحت بیان محصول مورد نظر بود.

اهداف: هدف از انجام این پژوهش، تکثیر و همسانه سازی شکل کامل و همچنین بخش ابتدایی ژن کشنده آلفا توکسین (α-Toxin) باکتری کلستریدیوم پرفرِینجنس با اندازه های به ترتیب 1100 و 750 جفت باز با استفاده از ناقل بیانی pET28a در باکتری E. coli بود. مواد و روش ها: استخراجDNA ژنومی با استفاده از کیت کیاژن صورت گرفت. آغازگرهای جلوبرنده و برگشت در آزمایشگاه طراحی و در ناحیه ابتدایی آغازگرها ردیف های آنزیم های برشگر HindIII و XhoI مطابق با ناحیه کلونینگ پلاسمید مورد نظر اضافه گردید. قطعات ژنی مورد نظر با روش PCR معمولی تکثیر و در ناقل pET28a با کمک روش شوک حرارتی کلون شدند. استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از روش لیز قلیایی صورت گرفت. نتایج: نتایج ژل الکتروفورز محصولات PCR، تکثیر واضح و واحد شکل کامل و همچنین بخش ابتدایی قطعات ژنی مورد نظر را مطابق با اندازه های مورد انتظار نشان داد. بعلاوه با استفاده از آزمایش هضم آنزیمی منفرد و دوگانه توسط آنزیم های برشگر HindIII و XhoI همسانه سازی ژنهای آلفا توکسین در باکتری میزبان و تولید باکتریهای نوترکیب تأیید شد. نتیجه گیری: با توجه به موفقیت آمیز بودن دقیق کلونینگ ژنهای آلفا توکسین در باکتری های بیانی میزبان، می توان گفت که پرایمرهای طراحی شده در این تحقیق برای تکثیر ژن آلفا توکسین بسیار اختصاصی بوده و به عنوان مارکر شناسایی و طبقه بندی این باکتری ها می توانند استفاده واقع شوند. همچنین با ساخت احتمالی واکسن های نوترکیب ژنتیکی مهندسی شده می توان کنترل و مقابله با پاتوژن های مهمی همچون باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس را امکان پذیر ساخت.

هدف: امروزه، افزایش جهانی قیمت ذرت در جیره طیور سبب جایگزینی گندم به جای ذرت شده است. اما وجود پلی ساکاریدهای غیرنشاسته ای در دیواره سلولی مانع جذب ترکیبات غذایی موجود در گندم توسط طیور می گردند. یکی از روش های حذف پلی ساکاریدهای غیرنشاسته ای موجود در گندم استفاده از آنزیم زایلاناز در جیره ی غذای طیور می باشد. زایلانازها سبب شکسته شدن پیوند اندو بتا (4-1) آرابینوزایلان در دیواره سلولی گندم می شود. هدف از این پژوهش تولید آنزیم نوترکیب مقاوم به حرارت زایلاناز در باکتری E. coli، به عنوان مکمل جیره غذایی طیور می باشد. مواد و روش ها: در این پژوهش ژن مقاوم به حرارت زایلاناز (xynA) در یک سیستم بیان ترشحی باکتریایی شامل: توالی شاین-دالگارنو، سیگنال پپتید ترشحی Usp45 و پروموتر T7 در پلاسمیدpET-22b (+) از باکتریE. coli سویه BL21 (DE3) با استفاده از روش شوک حرارتی کلون شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب زایلاناز از القاگر IPTG در زمان های مختلف استفاده گردید. همچنین، بررسی شاخص های کاتالیتیکی نیز طبق روش DNS صورت پذیرفت. یافته ها: نتایج حاصل از کلونی PCR وجود توالی ژن نوترکیب زایلاناز به طول bp 743 را بر روی ژل آگارز 1 درصد تأیید نمود. ژل اکریل آمید SDS-PAGE، حضور پروتئین با وزن مولکولی kDa 27 را نشان داد. همچنین میزان فعالیت پروتئین نوترکیب به مقدار 47/189 (unit/ml) با استفاده از روش DNS در دمای بهینه ° C65 و 6 pH= تعیین گردید. علاوه بر این، نتایج منحنی میکائیلیس-منتن میزان ثابت میکائیلیس (Km) و حداکثر سرعت واکنش (Vmax) را برای آنزیم نوترکیب زایلاناز به ترتیب 1/4 (mg/ml) و 87 (unit/ml) تعیین نمود. نتیجه گیری: زایلانازها مهمترین آنزیم های مکمل جیره طیور می باشند که در جیره های بر پایه گندم اضافه می شوند. نتایج نشان داد، آنزیم نوترکیب حاصل، دارای فعالیت و غلظت مناسب می باشد و مقاوم به حرارت است. همچنین آنزیم نوترکیب زایلاناز به دلیل خاصیت ترشحی بودن با هزینه اندک قابل استحصال می باشد.

اینترلوکین15 (IL-15)، سایتوکاینی است که به واسطه فعالیت های فیزیولوژیکی آن می تواند در درمان های ضدسرطان نقش ایفا کند. IL-15 باعث تمایز، تکثیر، فعال شدن و بقای سلول های کشنده طبیعی می شود و بقای لنفوسیت های T خاطره ای را بهبود می بخشد. از آنجایی که راندمان تولید و تخلیص این سایتوکاین عمدتا پایین است، علی رغم پیشرفت های اخیر، همچنان بهینه کردن شرایط تولید، ارزشمند است. بنابراین در مطالعه حاضر، اقدام به کلون و بیان ژن IL-15 انسانی در باکتری متفاوت با سویه های قبلی شد و به جای بیان در باکتری E. coli سویه رایج BL21، از سویه Rosetta (DE3) استفاده شد که قادر است با استفاده از کدون های نادری که در باکتری کمتر مورد استفاده قرار می گیرند، بیان ژن های یوکاریوتی را بهتر از سویه های دیگر انجام دهد، به طوری که پروتیین بیان شده شباهت بیشتری به پروتیین انسانی داشته باشد. پس از سنتز ژن IL-15، توالی مورد نظر در وکتور بیانی باکتریال pET28a کلون شد و پس از تایید با کلنیPCR، هضم آنزیمی با آنزیم های BamHI و XhoI و مشاهده باند 391 بازی روی ژل آگارز و تعیین توالی، در باکتری E. coli سویه Rosetta (DE) ترانسفورم شد. القای بیان در جذب نوری 6/0 در OD600 و در حضور 1میلی مولار ایزوپروپیل-بتا-دی-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG) انجام شد. مشاهده باند 15کیلودالتونی روی ژل SDS-PAGE و سپس انجام وسترن بلات به کمک آنتی بادی اختصاصی تجاری علیه IL-15، نشان از درستی فرآیند بیان داشت. راندمان بیان به کمک دانسیتومتری با نرم افزار Fiji حدود 37% تخمین زده شد. با توجه به اینکه بیان ژن انسانی IL-15 در سویه باکتریایی E. coli Rosetta (DE3) انجام شده است، انتظار می رود که در مطالعات بعدی، عملکرد مناسبی از خود نشان دهد. . .

ژن btuB از باکتری E. coli O157:H7 از 1845 جفت باز تشکیل شده است. این ژن پروتئین BtuB را کد می کند که پروتئین انتقال دهنده ویتامین B12 نامیده می شود. پروتئین BtuB برای جذب کوبالامین در باکتری E. coli ضروری است. این انتقال دهنده دارای دو بخش است: بخش بشکه ی بتا و بخش توپی. بخش توپی کانال ب شکه ی بتا را مسدود می کند. ویتامین B12 در حضور کلسیم با گرایش زیاد به پروتئین BtuB جذب می شود. لوپ های خارج سلولی L2 و L3 به ویتامین B12 متصل می شوند. ژن کدکننده پروتئین BtuB از باکتری E. coli O157:H7 تکثیر گردید. این ژن بصورت پروتئین واجد His (6)-tagged در انتهای C کلون و بیان گردید. ژن btuB با طراحی پرایمر ویژه با PCR تکثیر می شود. محصول PCR و وکتور انتخابی با آنزیم های تحدیدی برش و به هم متصل می شوند و تولید سازه ای (Construct) را می کنند که به میزبان E. coli BL21 (DE3) انتقال می یابند (Transformation)، سپس سلول های ترانسفورم شده پس از القا با IPTG و پس از آنالیز SDS-PAGE کل پروتئین فقط یک باند مشخص با وزن مولکولی 66KDa را آشکار کرد. با خالص سازی پروتئین BtuB وزن مولکولی دقیق آن معین گردید. با توجه به اینکه این پروتئین دارای لوپ های خارج سلولی فراوانی می باشد از این رو یکی از اهداف این پژوهش تولید و شناسایی پروتئین اتصالی پری پلاسمی انتقال دهنده ویتامین (BtuB) B12 از باکتری E. coli O157:H7 و هدف دیگر تعیین وزن دقیق مولکولی پروتئین BtuB است.

مقدمه: آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7، در رونویسی و بیان پروتئین های نوترکیب استفاده می شود. این آنزیم به فاکتور دیگری برای شناسایی پیشبر نیاز نداشته، بسیار اختصاصی عمل می کند و فقط ژن های تحت کنترل پیشبر T7 را بیان می-نماید. این ویژگی ها موجب شده است که تولید آنزیم T7 RNA پلیمراز در بیوتکنولوژی بسیار پر اهمیت باشد.مواد و روشها: در این تحقیق، برای تولید انبوه و کم هزینه این آنزیم، سویه باکتریوفاژ T7 به عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از آغازگر های اختصاصی که حاوی سایت برشی برای آنزیم های BamHI و EcoRI بود انجام گرفت. پس از الکتروفورز محصول PCR، ژن تکثیر شدهT7 RNA پلیمیراز و پلاسمید pGEX2TK توسط این آنزیم ها برش داده شدند و پس از خالص سازی، واکنش لیگاسیون بین آن ها صورت گرفت. پلاسمید نوترکیب pGEX-T7RNAPol با الکتروپوراسیون به باکتری E. coli منتقل شد. گزینش باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب به کمک PCR انجام گرفت. نتایج: پس از تایید پلاسمید حاصل، با برش آنزیمی و همچنین با PCR، توالی یابی آن انجام و درستی آن مطابق توالی ثبت شده در NCBI تایید شد. پلاسمید نوترکیب به منظور بیان پروتئین مورد نظر به باکتری E. coli سویه Rosetta منتقل شد. کلنی حاوی پلاسمید انتخاب وکشت شد. بیان پروتئین با القای IPTG در باکتری صورت گرفت و پس از استخراج به کمک SDS-PAGE تایید شد. این تحقیق پیش نیاز تولید تجاری و انبوه آنزیم T7 RNA پلیمراز می باشد که پس از بهینه سازی بیان و خالص سازی پروتئین، تولید تجاری و بومی آن انجام خواهد شد.

اهداف: در سال های اخیر نانولوله های کربنی به دلیل ویژگی های منحصر به فرد خود توجه بسیاری از محققان را به خود جلب کرده اند. در مطالعه حاضر، نانولوله های کربنی با استفاده از PEI پوشش داده شدند. سپس توانایی آنها برای انتقال ژن به سلول های باکتری اشریشیاکلی ارزیابی شد. مواد و روش ها: نانوذرات نانولوله-PEI از طریق برهمکنش بین گروه های آمین موجود در PEI با گروه های کربوکسیل نانولوله ها سنتز شدند. به منظور تهیه سازه ژنی مناسب برای انتقال به باکتری E. coli ژن Gus A از وکتور pBI121 به وکتور PUC-18 انتقال یافت (pUC-Gus). سپس کمپلکس های نانولوله-PEI-DNA با ترکیب نسبت های متفاوت وزنی (درصد وزنی/وزنی) از نانوذرات نانولوله-PEI (0/5، 1 و 2) با مقدار ثابت از وکتور pUC-Gus تهیه شدند و توسط ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفتند. به منظور ترانسفورماسیون باکتری E. coli، مقدار مناسبی از کمپلکس نانولوله-PEI-DNA به باکتری های E. coli اضافه شد. سپس به مدت 7 ساعت در دمای ° C37 شیک شدند. بازده ترانسفورماسیون باکتری ها از طریق شمارش کلنی و با استفاده از محیط LB جامد حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین بررسی شد. علاوه بر این از رنگ آمیزی Gus به منظور تایید عملکرد پلاسمید ترانسفورم شده استفاده شد. تعیین سمیت نانولوله-PEI با استفاده از روش MTT و در بازه های زمانی 6، 24 و 72 ساعت با غلظت های مختلف 10، 100 و 500میکروگرم بر میلی لیتر مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: نانوذرات نانولوله-PEI با موفقیت سنتز شدند. نانولوله های کربنی کاتیونی از قابلیت بالایی برای محافظت از DNA در برابر آسیب های ناشی از آنزیم های برشی برخوردار بودند. با افزایش غلظت نانوذرات نانولوله-PEI و همچنین مدت زمان انکوباسیون، درصد زنده مانی باکتری ها کاهش یافت. نتایج حاصل از الکتروفورز ژل آگارز از پلاسمید استخراج شده از باکتری های ترانسفورم شده پس از برش توسط آنزیم EcoRΙ نشان داد که پلاسمید pUC-Gus با موفقیت توسط نانوذرات نانولوله-PEI به سلول های باکتری E. coli انتقال یافته اند. نتیجه گیری: نانولوله های کربنی کاتیونی توانایی بالایی در انتقال ژن به باکتری E. coli دارند.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.